郭順星

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所

摘 要：藥用植物內(nèi)生真菌普遍存在于健康植物組織和器官中, 種類繁多, 分布廣泛。到目前為止, 人們已從大量藥用植物中分離出不同類型的內(nèi)生真菌, 這些植物廣泛分布于除南極洲以外的各種陸地生態(tài)系統(tǒng)中。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展, 藥用植物內(nèi)生真菌的研究也取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。由于內(nèi)生真菌對(duì)于藥用植物的重要性, 其相關(guān)研究也受到了世界各國(guó)學(xué)者的高度關(guān)注。本文總結(jié)現(xiàn)階段藥用植物內(nèi)生真菌相關(guān)研究, 并對(duì)未來(lái)研究的發(fā)展趨勢(shì)做出展望。

關(guān)鍵詞：藥用植物; 內(nèi)生真菌; 菌根真菌;

The recent progress and prospects of research on endophytic fungi in medicinal plants

GUO Shun-Xing

Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences;

Abstract：Endophytic fungi are ubiquitous in the health tissues and organs of medicinal plants, with a great number of species and a wide range of distribution.To date, a large number of species have been isolated from diverse medicinal plants distributed in various ecological environments in the world, except Antarctica.With the rapid development of modern science and technology, the research on endophytic fungi in medicinal plants has achieved remarkable progress.In this paper, research progress on endophytic fungi in medicinal plant is summarized, and the future development trend in this field is expected and predicted.

Keyword：medicinal plants; endophytic fungi; mycorrhizal fungi;

　　藥用植物內(nèi)生真菌的研究, 涉及植物學(xué)、微生物學(xué)、農(nóng)學(xué)、化學(xué)、藥學(xué)、分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等學(xué)科。它與一般植物內(nèi)生真菌研究的不同之處在于:它不僅研究?jī)?nèi)生真菌的多樣性, 而且重點(diǎn)研究?jī)?nèi)生真菌對(duì)藥用植物生長(zhǎng)發(fā)育的作用, 對(duì)藥用部位活性物質(zhì)形成、含量變化和臨床藥效的影響, 以及與藥材道地性的關(guān)系。該領(lǐng)域的研究, 尤其重要的是可根據(jù)藥用植物與真菌密切關(guān)系的特性, 利用現(xiàn)代技術(shù)手段, 研究某些瀕危緊缺藥用植物資源保護(hù)和可持續(xù)利用的關(guān)鍵問(wèn)題。

　　藥用植物內(nèi)生真菌研究的目的和意義, 是根據(jù)內(nèi)生真菌與藥用植物互作及其協(xié)同進(jìn)化的生物學(xué)特性, 研究解決珍稀瀕危藥用植物資源保護(hù)和可持續(xù)利用的關(guān)鍵問(wèn)題。利用幾乎所有植物都有內(nèi)生真菌這一自然特點(diǎn), 開(kāi)展內(nèi)生真菌在藥用植物生長(zhǎng)發(fā)育和活性成分形成中的應(yīng)用研究, 既不改變其遺傳背景, 又能達(dá)到藥材“道地性”的要求。從內(nèi)生真菌生物學(xué)理論出發(fā), 以應(yīng)用基礎(chǔ)研究為主, 為我國(guó)藥用植物資源保護(hù)和可持續(xù)利用提供可靠的理論依據(jù)及強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。所以, 藥用植物內(nèi)生真菌生物學(xué)研究對(duì)闡明藥用植物分布、藥用植物生長(zhǎng)發(fā)育特性、藥材道地性、藥效物質(zhì)形成和積累、藥用植物資源再生具有重要意義。

1 藥用植物與內(nèi)生真菌

　　藥用植物, 是指醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中用于預(yù)防和治療疾病的一類植物, 藥用植株的全部或一部分供臨床使用或作為制藥工業(yè)的原料。廣義而言, 還可以包括用作營(yíng)養(yǎng)劑、保健食品、農(nóng)藥和獸醫(yī)用藥的植物資源。

　　內(nèi)生真菌是指生活在植物細(xì)胞中或在其生活史某一時(shí)期生活在植物組織內(nèi), 對(duì)植物組織沒(méi)有引起明顯病害的一類真菌。廣義而言, 還包括那些在生活史中的某一階段營(yíng)表面生的腐生菌, 對(duì)宿主暫時(shí)沒(méi)有傷害的潛伏性病原真菌和菌根真菌 (Smith&Read 2008) 。

　　人類對(duì)內(nèi)生真菌的研究始于19世紀(jì)末, 對(duì)于植物內(nèi)生真菌的研究已有100多年的歷史, 早在1898年人們就從黑麥草Lolium temulentum L.中分離得到了首株內(nèi)生真菌 (Lin et al.2007) 。此后的幾十年內(nèi), 植物內(nèi)生真菌的研究范圍僅限于一些重要的經(jīng)濟(jì)植物中。直到1993年, 美國(guó)科學(xué)家從藥用植物太平洋短葉紅豆杉Taxus brevifolia韌皮部中分離到1株能產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae Strobel et al. (Stierle et al.1993) , 人們才真正意識(shí)到內(nèi)生真菌是人類尋找新型藥用活性成分的重要潛在原料, 尤其是藥用植物中內(nèi)生真菌的相關(guān)研究, 已經(jīng)成為全世界科學(xué)家研究的熱點(diǎn)之一。隨后植物內(nèi)生真菌的研究范圍也慢慢擴(kuò)展到藻類、地衣、蕨類等低等植物。

　　幾乎所有的植物都存在內(nèi)生真菌, 它們生活在植物體內(nèi)的特殊環(huán)境中, 并與宿主植物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化, 在漫長(zhǎng)的共進(jìn)化過(guò)程中彼此構(gòu)成了穩(wěn)定的生態(tài)關(guān)系。目前, 對(duì)二者之間的關(guān)系一般分為兩種觀點(diǎn)。一種觀點(diǎn)將其描述為互惠互利的共生關(guān)系, 內(nèi)生真菌可以從宿主植物中吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供給自己生長(zhǎng)發(fā)育的需要, 內(nèi)生真菌也可以提高宿主植物對(duì)脅迫環(huán)境如病蟲害、干旱和水澇等的適應(yīng)性和抗性, 并在宿主植物的生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖中起重要的作用。另一種觀點(diǎn)認(rèn)為二者是特殊的寄生關(guān)系, 這種寄生一般不引起植物的相關(guān)病癥, 而當(dāng)植物衰老或受到環(huán)境脅迫時(shí)又會(huì)變成病原菌而引起植物病害, 即內(nèi)生真菌和宿主植物之間是一種處于動(dòng)態(tài)平衡的拮抗關(guān)系 (Aly et al.2011) 。

　　內(nèi)生真菌與藥用植物形成共生關(guān)系的過(guò)程涉及細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、信號(hào)識(shí)別、轉(zhuǎn)導(dǎo)、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)交換和基因表達(dá)等一系列復(fù)雜的過(guò)程。內(nèi)生真菌分布于藥用植物的根、莖、葉、花、果實(shí)和種子等各個(gè)部位, 二者形成共生關(guān)系的過(guò)程一般分為接觸、侵入和定殖等過(guò)程。在侵染早期, 雙方各自釋放信息素類似物并被彼此識(shí)別, 內(nèi)生真菌可以菌絲或孢子形式通過(guò)變形、吸器或滲透等多種途徑對(duì)宿主植物進(jìn)行侵染, 也可以通過(guò)分解植物表皮細(xì)胞壁或通過(guò)各種自然孔口 (包括側(cè)根發(fā)生處、氣孔、水孔等) 或傷口 (包括土壤對(duì)根的磨損、病蟲對(duì)植物的損害及收割植物造成的傷口等) 等傳播途徑進(jìn)入植物。真菌侵染植物時(shí), 植物會(huì)發(fā)生一系列的反應(yīng), 如植物本身的結(jié)構(gòu)阻止真菌的侵入, 植物組織和細(xì)胞發(fā)生多種變化阻止真菌侵入等, 同時(shí)真菌分泌多種物質(zhì)幫助自身進(jìn)入植物體內(nèi), 這期間發(fā)生非常復(fù)雜的物理和化學(xué)反應(yīng), 經(jīng)過(guò)侵染與反侵染后, 內(nèi)生真菌在植物的表皮、皮層、葉肉細(xì)胞等處定殖, 很少或不侵入維管系統(tǒng)。在這些組織內(nèi), 內(nèi)生真菌一般以菌絲的形態(tài)存在, 少數(shù)真菌可以形成厚垣孢子、微菌核、小囊泡等結(jié)構(gòu)。

　　直到現(xiàn)在, 每年仍然從各種植物中分離、鑒定出大量的內(nèi)生真菌, 然后再研究其功能及實(shí)際應(yīng)用。總結(jié)近年來(lái)藥用植物內(nèi)生真菌的研究?jī)?nèi)容, 大致體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。

1.1 藥用植物內(nèi)生真菌的分離、鑒定及多樣性

　　藥用植物內(nèi)生真菌普遍存在于健康植物組織和器官中, 種類繁多, 分布廣泛。到目前為止, 人們已從多種藥用植物中分離出不同類型的內(nèi)生真菌, 這些植物廣泛分布于除南極洲以外的世界各地, 生態(tài)環(huán)境有很大差異, 從中分離到的內(nèi)生真菌物種種類繁多, 涉及子囊菌、擔(dān)子菌、接合菌、無(wú)孢菌類等類群。雖然從植物體內(nèi)能夠分離得到大量的內(nèi)生真菌類群, 但是由于內(nèi)生真菌與宿主間具有一定的專一性, 假設(shè)每種宿主體內(nèi)包含有4、5種專性內(nèi)生真菌, 以地球目前已知的25萬(wàn)種植物數(shù)量計(jì)算, 內(nèi)生真菌數(shù)量可大于100萬(wàn)種 (林燕青和洪偉2012) 。

1.2 內(nèi)生真菌對(duì)藥用植物生長(zhǎng)、發(fā)育的影響

　　在過(guò)去的數(shù)十年里, 研究表明內(nèi)生真菌影響著藥用植物生理進(jìn)程的不同方面。如:從滇重樓根狀莖分離到8株能促進(jìn)滇重樓胚發(fā)育的內(nèi)生真菌;茅蒼術(shù)與其內(nèi)生真菌共生培養(yǎng)后, 其組培苗葉片、根的鮮重和干重明顯增加;蘭科藥用植物的內(nèi)生真菌能產(chǎn)生吲哚乙酸、赤霉素、脫落酸、玉米素等植物激素;苦皮藤根韌皮部分離的內(nèi)生真菌對(duì)黏蟲、小菜蛾都具有較強(qiáng)的胃毒活性;苦楝中分離出的內(nèi)生真菌對(duì)馬尾松毛蟲有抗蟲活性 (孫奎2010;丁常宏等2013;解修超等2013) 。以上研究可以看出:首先, 藥用植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生植物生長(zhǎng)所需的調(diào)節(jié)劑類物質(zhì), 以增強(qiáng)植株對(duì)微量元素的吸收, 進(jìn)而促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育;其次, 藥用植物內(nèi)生真菌能夠提高宿主植物的生理活性指標(biāo);再次, 藥用植物內(nèi)生真菌能夠提高宿主植物抗逆性, 包括生物脅迫與非生物脅迫;最后, 藥用植物內(nèi)生真菌是某些特殊植物的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源, 是保障其正常生長(zhǎng)發(fā)育、生殖遺傳必不可少的重要條件。

1.3 內(nèi)生真菌對(duì)藥用植物次生代謝產(chǎn)物、活性物質(zhì)的調(diào)節(jié)

　　內(nèi)生真菌通過(guò)影響和調(diào)節(jié)藥用植物次生代謝產(chǎn)物的合成、含量及累積, 直接或者間接地影響藥用植物活性物質(zhì)的分布、含量。例如:絲核菌株R02和R04能促進(jìn)金線蓮葉片超氧化物歧化酶、根系酸性和堿性磷酸酶活性以及抗壞血酸、多酚、類黃酮和多糖化合物含量;鐵皮石斛內(nèi)生真菌能促進(jìn)鐵皮石斛次生代謝產(chǎn)物的積累, 增加多糖含量;大戟內(nèi)生真菌接種到大戟組培苗上, 發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌E4和E5均能促進(jìn)大戟組培苗中兩種萜類物質(zhì)異大戟素、大戟醇的合成;刺五加內(nèi)生真菌可顯著影響刺五加中皂苷合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量, 進(jìn)而影響刺五加的皂苷含量 (曾培源和吳錦忠2010;何新華等2012;丁常宏等2013) 。

1.4 藥用植物內(nèi)生真菌的培養(yǎng)及替代藥用植物

　　目前許多藥用植物資源枯竭, 而多種高效的藥用活性成分難以人工合成, 或合成藥物難以發(fā)揮相同功效。普遍存在于藥用植物組織和器官中的內(nèi)生真菌具有豐富的多樣性, 部分內(nèi)生真菌在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性物質(zhì)在藥物研發(fā)、植物病害生物防治等方面表現(xiàn)出了巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及應(yīng)用前景, 因此受到世界各國(guó)科學(xué)家的廣泛關(guān)注。1993年人們首次從短葉紅豆杉中分離得到一株能合成抗癌物質(zhì)紫杉醇的內(nèi)生真菌, 這表明有的內(nèi)生真菌具有合成和宿主植物相同或相似活性成分的能力。較為成功的例子還有:裂褶菌屬Schizophyllum內(nèi)生真菌能產(chǎn)生三尖杉酯堿類物質(zhì), 能抑制真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成, 是一類潛在的抗癌藥物;銀杏的內(nèi)生真菌裂褶菌Schizophyllum發(fā)酵液和菌絲體產(chǎn)黃酮類成分槲皮素;長(zhǎng)春花分離得到的尖孢鐮刀菌可培養(yǎng)產(chǎn)生長(zhǎng)春新堿等 (徐范范等2010;丁海娥等2013;周永強(qiáng)等2014) 。總體來(lái)講, 藥用植物內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物與藥物開(kāi)發(fā)的關(guān)注點(diǎn)主要在以下幾個(gè)方面:首先, 抗腫瘤活性物質(zhì), 如內(nèi)生真菌培養(yǎng)物產(chǎn)紫杉醇和紫杉烷類、長(zhǎng)春新堿、鬼臼毒素、喜樹堿等;其次, 抗菌活性物質(zhì), 如縮酚酸環(huán)醚、萘醌類等;再次, 抗氧化活性物質(zhì), 如黃酮及類黃酮、酚類、多糖等;最后, 抗炎活性物質(zhì), 如香豆素類等。

2 藥用植物內(nèi)生真菌研究現(xiàn)狀

　　近7年來(lái) (2010–2017年) , 國(guó)內(nèi)外發(fā)表了許多與藥用植物內(nèi)生真菌相關(guān)的研究論文、綜述、會(huì)議報(bào)告。通過(guò)Web of Science統(tǒng)計(jì)得出核心庫(kù)期刊發(fā)表的近5年與藥用植物內(nèi)生真菌 (medicinal plant and endophytic fungi) 相關(guān)論文共計(jì)272篇, 其中2010年 (26篇) 、2011年 (29篇) 、2012年 (61篇) 、2013年 (32篇) 、2014年 (27篇) 、2015年 (30篇) 、2016年 (34篇) 、2017年 (33篇) 。研究較為熱門的國(guó)家包括中國(guó)、印度、巴西、泰國(guó)、美國(guó)、德國(guó)、日本、韓國(guó)、墨西哥和馬拉西亞等。

2.1 各國(guó)藥用植物內(nèi)生真菌研究概況

　　近年來(lái), 中國(guó)藥用植物內(nèi)生真菌的研究開(kāi)展較為廣泛, 包括鐵皮石斛、天麻、金線蓮、降香、滇重樓、盾葉薯蕷、沉香、銀杏、無(wú)花果、多花黃精等, 主要研究了內(nèi)生真菌對(duì)藥用植物生長(zhǎng)發(fā)育、種子萌發(fā)、有效成分累積等方面的作用, 以及從藥用植物內(nèi)生真菌中篩選分離出具有抗菌、抗炎和抗腫瘤的天然活性物質(zhì)。中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所郭順星課題組以鐵皮石斛、天麻、金線蓮以及樹脂類藥材沉香和降香、藥用真菌豬苓等為研究對(duì)象, 主要研究?jī)?nèi)生真菌對(duì)藥用植物生長(zhǎng)發(fā)育、種子萌發(fā)、藥效成分累積、活性物質(zhì)變化等方面的功能, 并應(yīng)用于實(shí)際栽培、生產(chǎn)及產(chǎn)品開(kāi)發(fā) (Chen et al.2011;Chen et al.2013;Sun et al.2015) 。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)周立剛課題組從多種藥用植物及其內(nèi)生真菌和病原真菌中尋找新型具生物活性的次生代謝產(chǎn)物, 從次生代謝的角度探討植物與內(nèi)生真菌之間的相互作用和協(xié)同進(jìn)化關(guān)系, 并利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段, 有效提高活性成分的產(chǎn)量, 為其應(yīng)用提供依據(jù) (Li et al.2014;Shan et al.2014;Tian et al.2017) 。浙江大學(xué)章初龍課題組開(kāi)展了藥用植物沉香、銀杏、無(wú)花果、多花黃精等內(nèi)生真菌的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用開(kāi)發(fā), 該課題組從藥用植物內(nèi)生真菌中篩選分離出幾十種具有抗菌活性物質(zhì)的天然產(chǎn)物, 并將其應(yīng)用到生物農(nóng)藥的研究開(kāi)發(fā), 如木霉菌素、產(chǎn)氣霉菌等 (Wang et al.2011) 。西北農(nóng)林科技大學(xué)唐明課題組進(jìn)行了林木菌根真菌種質(zhì)資源、生態(tài)分布和生物多樣性的研究, 并利用菌根真菌提高枸杞、刺槐、垂柳等植物的抗逆性, 詳細(xì)分析了菌根真菌提高植物耐旱、耐病蟲害的分子遺傳特性 (Zhang et al.2012) 。廈門大學(xué)沈月毛課題組利用藥用植物內(nèi)生真菌發(fā)現(xiàn)了多種抗腫瘤和抗菌新化合物 (Wang et al.2010) 。此外, 我國(guó)科學(xué)家最新的研究還包括從人參中分離得到兩株新的內(nèi)生真菌Fusarium sp.PN8和Aspergillus sp.PN17, 具有抗菌活性, 并且可用于發(fā)酵制備人參皂苷等成分 (Jin et al.2017) ;研究分析了內(nèi)生真菌Gilmaniella sp.AL12通過(guò)影響乙烯信號(hào)通路, 介導(dǎo)蒼術(shù)倍半萜的生物合成等 (Yuan et al.2016) 。由此看出, 我國(guó)科學(xué)家在藥用植物內(nèi)生真菌的研究中, 取得了豐碩的成果。

　　印度科學(xué)家對(duì)藥用植物內(nèi)生真菌的研究也處于熱點(diǎn)狀態(tài), 印度同為四大文明古國(guó), 其傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)包括阿育吠陀、尤納尼、西達(dá)等, 有著豐富的傳統(tǒng)藥用植物資源, 同樣也擁有豐富的內(nèi)生真菌資源。近年來(lái), 印度巴納拉斯大學(xué) (Banaras Hindu University) 的Kharwar課題組發(fā)表多篇論文 (Kharwar et al.2010;Kharwar et al.2011;Gond et al.2012;Kharwar et al.2012) , 他們從印度傳統(tǒng)藥夜花屬夜茉莉Nyctanthes arbor‐tristis中分離得到19種內(nèi)生真菌, 研究了其多樣性和抗菌活性;該課題組還從檸檬桉Eucalyptus citriodora的葉片中得到了內(nèi)生真菌與外生真菌, 并比較了二者的抗菌活性。此外, 印度科學(xué)家最新的研究還包括:從印度藥用植物黃花稔Sida acuta中分離得到具有抗菌活性的硫色曲霉Aspergillus sulphureus, 可抗金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌、傷寒桿菌 (Murali et al.2017) ;發(fā)現(xiàn)光果甘草的內(nèi)生真菌腐皮鐮刀菌Fusarium solani具有抗結(jié)核的作用 (Shah et al.2017) ;從印度芳香植物檸檬馬薄荷Monarda citriodora分離得到28株內(nèi)生真菌, 分別來(lái)自11個(gè)屬, 包括鐮刀菌、黃曲霉、Muscodor等, 具有開(kāi)發(fā)植物生物防治物質(zhì)的潛力 (Katoch&Pull 2017) ;并發(fā)現(xiàn)姜黃Curcuma longa的內(nèi)生真菌莖點(diǎn)霉菌Phoma herbarum具有拮抗斑葉病的活性等 (Gupta et al.2016) 。

　　巴西地處南美洲東部, 由亞馬遜河孕育出豐富的植被資源, 共有植物4萬(wàn)多種, 許多植物用于醫(yī)療保健、防治疾病。多樣的氣候、地理?xiàng)l件使得其內(nèi)生真菌資源十分豐富。巴西米納斯聯(lián)邦大學(xué) (Federal University of Minas Gerais) Rosa Luiz和Rosa Carlos等科學(xué)家所在課題組近年來(lái)發(fā)表了多篇從巴西傳統(tǒng)藥用植物中得到的內(nèi)生真菌相關(guān)論文 (Rosa et al.2012;Vieira et al.2012;Rosa et al.2013;Vieira et al.2014) 。他們從茄科植物Solanum cernuum中分離出246種各類內(nèi)生真菌、豆科植物Stryphnodendron adstringens中鑒定出25屬320種內(nèi)生真菌, 并發(fā)現(xiàn)多種藥用植物內(nèi)生真菌具有強(qiáng)烈抗菌活性, 他們還詳細(xì)研究了菊科藥用植物Smallanthus sonchifolius中內(nèi)生真菌Coniochaeta ligniaria (Grev.) Massee的抗菌活性。此外, 巴西科學(xué)家最新的研究還包括, 發(fā)現(xiàn)間座殼菌Diaporthe sp.產(chǎn)物β‐ (1‐3, 1‐6) ‐d‐glucans具有抗惡性細(xì)胞增殖作用 (Orlandelli et al.2017) ;從野木藍(lán)Indigofera suffruticosa葉片中分離得到65株內(nèi)生真菌, 其中18株具有抗細(xì)菌活性等 (Dos et al.2015) 。

　　泰國(guó)處于熱帶氣候, 雨林資源豐富, 藥用植物及內(nèi)生真菌分布廣泛。宋卡王子大學(xué) (Prince Songkla University) 的Phongpaichit課題組從3種藥用海草中分離鑒定出160種潛在的內(nèi)生真菌, 并研究了它們的抗菌活性 (Supaphon et al.2013) 。清邁大學(xué) (Chiang Mai University) 的Lumyong課題組從樟科鈍葉桂Cinnamomum bejolghota分離出2 774株內(nèi)生真菌, 此外他們還從分子形態(tài)特征鑒定出Muscodor屬4種新的內(nèi)生真菌 (Suwannarach et al.2012;Suwannarach et al.2013) 。此外, 泰國(guó)科學(xué)家最新的研究還包括, 從傳統(tǒng)藥用植物Melodorum fruticosum的花中分離得到52株內(nèi)生真菌, 其中間座殼菌Diaporthe spp.具有抗菌和抗氧化的作用 (Tanapichatsakul et al.2017) ;在沉香Aquilaria subintegra樹脂部位發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌33株, 并從其中4株的發(fā)酵產(chǎn)物中, 得到沉香樹脂類似的化合物, 且具有抗氧化活性 (Monggoot et al.2017) 。

　　美國(guó)擁有廣袤的平原和山區(qū)資源, 藥用植物和內(nèi)生真菌的研究也處于先進(jìn)水平, 不僅研究本國(guó)資源, 還跨區(qū)域與墨西哥、印度、巴西等國(guó)合作開(kāi)展了更為廣泛的研究。近年來(lái), 美國(guó)本土藥用植物內(nèi)生真菌研究以馬里蘭大學(xué) (Maryland University) Gazis課題組為代表, 他們從橡膠樹Hevea brasiliensis葉和莖中共分離出175株內(nèi)生真菌, 采用了ITS和LSU序列片段對(duì)其進(jìn)行了分類鑒定, 其中97%屬于子囊菌, 而擔(dān)子菌僅占1%;而又以Penicillium、Pestalotiopsis和Trichoderma這3屬最多;在葉片中比莖中分離得到更多的內(nèi)生真菌。以上結(jié)果顯示, 橡膠樹內(nèi)生真菌具有多樣性, 不同部位具有不同類型的內(nèi)生真菌 (Gazis&Chaverri2010) 。此外, 美國(guó)科學(xué)家最新的研究還包括, 從西棲蓼的Persicaria amphibia內(nèi)生真菌Montagnulaceae sp.DM0194得到Azaphilones類化合物Montagnuphilones A‐G, 具有細(xì)胞毒性 (Luo et al.2017) ;從內(nèi)生真菌踝節(jié)菌屬Talaromyces minioluteus分離得到Meroterpenoids化合物Talarolutins A‐D, 具有對(duì)前列腺癌的細(xì)胞毒性 (Kaur et al.2016) ;從龍血樹Dracaena draco內(nèi)生真菌可可球二孢菌Botryodiplodia theobromae Pat.分離得到抗細(xì)菌活性物質(zhì)等 (Zaher et al.2015) 。

　　德國(guó)科學(xué)家對(duì)藥用植物內(nèi)生真菌的研究具有較高水平, 杜塞爾多夫大學(xué) (Dusseldorf University) 的Proksch Peter課題組對(duì)高等植物內(nèi)生真菌的化學(xué)成分進(jìn)行了全面的綜述, 詳盡地闡述了內(nèi)生真菌是提供新的天然藥用化合物的寶庫(kù) (Aly et al.2010) , 該文詳細(xì)描述了在內(nèi)生真菌研究中取得重大成就的紫杉醇、喜樹堿和鬼臼毒素等化合物, 以及各種活性物質(zhì)的抗菌、抗寄生蟲和細(xì)胞毒素作用等, 并分析了利用藥用植物內(nèi)生真菌生產(chǎn)藥物的影響因素。德國(guó)天然產(chǎn)物研究所 (HKI) 的Hertweck Christian課題組研究了藥用植物鬼針草Bidens pilosa內(nèi)生真菌Botryosphaeria rhodina Berk.&M.A.Curtis的化學(xué)成分Botryorhodines A‐D, 描述了其抗真菌活性和細(xì)胞毒性 (Abdou et al.2010) 。多特蒙德大學(xué) (TU Dortmund University) Kayser Oliver課題組從大麻中分離出了30種內(nèi)生真菌, 并研究了它們的多樣性和作為介質(zhì)在植物真菌體系中發(fā)揮的作用 (Kusari et al.2013) 。此外, 德國(guó)科學(xué)家還在光黑殼屬內(nèi)生真菌Preussia similis發(fā)現(xiàn)二環(huán)聚酮化合物Preussilides A‐F具備的抗惡性細(xì)胞增殖作用等 (Noumeur et al.2017) 。

　　日本對(duì)于藥用植物內(nèi)生真菌的研究開(kāi)展的時(shí)間較早, 也較為深入, 并且擅長(zhǎng)國(guó)際合作。東京大學(xué)Abe課題組從曼陀羅Datura stramonium中得到的內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生真菌毒素物質(zhì) (Sun et al.2012) ;大阪大學(xué)的Nihira課題組從內(nèi)生真菌Bipolaris sp.中得到了化學(xué)物質(zhì)Bipolamides, 深入分析了其化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理活性 (Siriwach et al.2014) ;山口大學(xué)Ito課題組和埃及科學(xué)家合作, 從埃及天仙子中分離得到多種抗真菌藥用活性的內(nèi)生真菌 (Abdel‐Motaal et al.2010) ;山形大學(xué)Shiono課題組研究了藥用植物內(nèi)生真菌鐮刀菌中聚酮化合物的代謝途徑 (Shiono et al.2013) 。此外, 日本科學(xué)家還從藥用植物Coccinia grandis葉片中分離得到內(nèi)生真菌稻黑孢霉Nigrospora oryzae (B.&Br.) Petch, 具有很強(qiáng)的抗病原真菌活性 (Thanabalasingam et al.2015) 。

  　　韓國(guó)也對(duì)本國(guó)的藥用植物內(nèi)生真菌進(jìn)行了一定的研究。建國(guó)大學(xué)的Kumaran課題組從Morinda citrifolia中分離出可可毛色二孢Lasiodiplodia theobromae, 并研究發(fā)現(xiàn)它能分泌紫杉酚, 具有很強(qiáng)的抗癌活性 (Pandi et al.2011) 。漢城國(guó)立大學(xué)Diederich課題組研究了內(nèi)生真菌Stemphylium globuliferum (Vestergr.) E.G.的代謝產(chǎn)物altersolanol A, 發(fā)現(xiàn)這類物質(zhì)具有很強(qiáng)的抗癌活性, 并對(duì)其抗癌機(jī)制進(jìn)行了深入研究 (Teiten et al.2013) 。此外, 韓國(guó)忠南大學(xué)Yu課題組從韓國(guó)栽培的枸杞中得到了10種內(nèi)生真菌 (Paul et al.2014) 。

　　墨西哥科學(xué)家近年來(lái)也分離得到多種藥用植物內(nèi)生真菌, 并研究了它們的化學(xué)成分。研究機(jī)構(gòu)Cinvestav IPN的Rivera‐Orduna課題組從墨西哥紅豆杉Taxus globosa中一共分離鑒定了116種內(nèi)生真菌 (Rivera‐Orduna et al.2011) 。墨西哥國(guó)立自治大學(xué) (Univ Nacl Autonoma Mexico) 的Mata課題組研究了來(lái)自內(nèi)生真菌的化合物Thielavins A, 發(fā)現(xiàn)其具有α‐葡糖苷酶抑制劑作用 (Rivera‐Chavez et al.2013) 。

　　馬來(lái)西亞與泰國(guó)氣候環(huán)境相似, 同樣擁有多樣的藥用植物資源和內(nèi)生真菌資源。馬來(lái)西亞布特拉大學(xué) (University Putra Malaysia) 的Cheah課題組采用分子特征結(jié)合形態(tài)特征的方法, 從2種藤黃屬Garcinia植物鑒定了24種內(nèi)生真菌 (Sim et al.2010) 。馬來(lái)西亞理科大學(xué) (University Sains Malaysia) 的Tong課題組從Orthosiphon stamineus中分離了72種內(nèi)生真菌, 并研究了其中的抗菌活性 (Tong et al.2011) 。Teknol大學(xué)的Ramasamy則綜述了馬來(lái)西亞藥用植物內(nèi)生真菌的化學(xué)成分, 尤其是其具有的抗菌活性和細(xì)胞毒性 (Ramasamy et al.2010) 。

此外, 我國(guó)臺(tái)灣食品工業(yè)發(fā)展研究所Cheng課題組研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生真菌Biscogniauxia formosana、Annulohypoxylon squamulosum和Annulohypoxylon ilanense的次生代謝產(chǎn)物具有抗細(xì)菌、抗真菌和細(xì)胞毒活性 (Cheng et al.2012a, 2012b;Wu et al.2013) 。澳大利亞國(guó)立大學(xué) (Australian Natl Univ) 研究了內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物Pestalotiopsones D‐E, 描述了其化學(xué)構(gòu)型和潛在活性 (Beekman&Barrow 2013) 。瑞典Umea大學(xué)科學(xué)家從山楊樹Populus tremula葉片中分離了1 000多種內(nèi)在真菌, 鑒定為100多種形態(tài)群, 采用18S和ITS序列片段對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行了分子鑒定, 多數(shù)內(nèi)生真菌屬于擔(dān)子菌和子囊菌, 如Sordariomycetes和Dothideomycetes。該文詳細(xì)分析了楊樹葉片內(nèi)生真菌的種群特征和多樣性, 鑒定出多種病原菌和抗病活性的內(nèi)生真菌, 為以后的應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供了有力的數(shù)據(jù)支持 (Albrectsen et al.2010) 。

2.2 國(guó)際合作

　　國(guó)際合作在藥用植物內(nèi)生真菌的研究也有了廣泛開(kāi)展, 其中美國(guó)、日本等發(fā)達(dá)國(guó)家常常與巴西、泰國(guó)、印度等資源豐富的國(guó)家展開(kāi)合作。近年來(lái)最為代表性的一篇文章便是由匈牙利、德國(guó)、中國(guó)、埃及四國(guó)科學(xué)家共同參與的一項(xiàng)研究, 該研究以紅樹Laguncularia racemosa.內(nèi)生真菌Corynespora cassiicola (Berk.&M.A.Curtis) C.T.Wei為基礎(chǔ), 深入研究了其癸內(nèi)酯衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性, 他們發(fā)現(xiàn)兩種異構(gòu)體能對(duì)人體的多種酶, 如IGF1‐R和VEGF‐R2, 產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用 (Ebrahim et al.2012) 。

　　泰國(guó)皇太后大學(xué)、中國(guó)科學(xué)院和沙特阿拉伯國(guó)王大學(xué)三國(guó)合作完成的綜述, 從形態(tài)、系統(tǒng)進(jìn)化、生物化學(xué)和多樣性等多方面分析了藥用植物內(nèi)生真菌Pestalotiopsis sp.的各個(gè)特征。文章綜述了該屬真菌在鑒定難點(diǎn)、分類學(xué)上的分歧, 采用菌絲形態(tài)、ITS序列特征、化學(xué)特征等多種方式來(lái)研究Pestalotiopsis、Pestalotia及相關(guān)內(nèi)生真菌的異同, 描述了它們?cè)卺t(yī)藥開(kāi)發(fā)中的潛力 (Maharachchikumbura et al.2011) 。

中英科學(xué)家合作, 總結(jié)了內(nèi)生真菌與藥用植物之間的“友好”關(guān)系, 并進(jìn)行了綜述。該文總結(jié)以往研究發(fā)現(xiàn), 內(nèi)生真菌對(duì)于藥用植物而言, 是一種中藥的微生態(tài)環(huán)境, 經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化, 內(nèi)生真菌可影響藥用植物的生物合成、次生代謝、藥材產(chǎn)量和品質(zhì)、宿主植物生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性、抗病性等諸多方面。本文對(duì)過(guò)去30年的研究進(jìn)行歸納, 被廣泛引用。此外, 他們還總結(jié)了1990–2013年具有抗癌活性的內(nèi)生真菌研究, 并歸納了抗癌活性物質(zhì) (Chen et al.2016;Jia et al.2016) 。

3 藥用植物內(nèi)生真菌研究展望

　　近30年來(lái), 已經(jīng)從數(shù)百種藥用植物中分離鑒定出大量的內(nèi)生真菌, 檢測(cè)并純化出較多的活性物質(zhì), 取得了豐碩的成果, 但很多問(wèn)題仍然存在:表面消毒不徹底導(dǎo)致外源真菌混入內(nèi)生真菌中, 形成錯(cuò)誤的研究結(jié)果, 然而嚴(yán)格的表面消毒過(guò)程往往誤殺了很多內(nèi)生真菌;在藥用植物內(nèi)生真菌分離過(guò)程中即使采用多種培養(yǎng)基也不能保證全部的內(nèi)生真菌都被分離出來(lái), 如一些生長(zhǎng)較慢的真菌、不能在人工培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的真菌等;藥用植物內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物含量往往較低, 加之分離純化及頻繁傳代導(dǎo)致其代謝產(chǎn)物的特性和含量不穩(wěn)定, 給后續(xù)的檢測(cè)和分離工作增加了難度;內(nèi)生真菌與宿主的相互關(guān)系的機(jī)理尚不明確, 分子機(jī)制的研究成果更加稀少, 造成知其然不知其所以然的現(xiàn)狀;目前對(duì)藥用植物內(nèi)生真菌的研究主要集中在實(shí)驗(yàn)階段, 其實(shí)際應(yīng)用的效果還亟待研究和實(shí)踐。

　　如今, 大量現(xiàn)代化科技手段已被引入到藥用植物內(nèi)生真菌的研究領(lǐng)域, 如印度科學(xué)家已完成內(nèi)生真菌Diaporthe ampelina (Phomopsis sp.) 的全基因組測(cè)序 (Savitha et al.2016) ;蘭科植物天麻、金線蓮、鐵皮石斛與內(nèi)生真菌相互作用的轉(zhuǎn)錄組研究 (Liu et al.2015;Chen et al.2017;Zeng et al.2017) ;Terminalia laxiflora Engl&Diels內(nèi)生真菌Curvularia sp.的代謝組分析等 (Tawfike et al.2017) 。可以展望, 未來(lái)更多新技術(shù)的應(yīng)用, 將提升藥用植物內(nèi)生真菌研究的整體水平。

　　從本期發(fā)表的論文來(lái)看, 在內(nèi)生真菌多樣性方面涉及到的藥用植物包括新疆天山雪蓮、紅景天、手參、馬比木等, 所采用的研究方法包括傳統(tǒng)的分離鑒定以及基于Illumina Mi Seq平臺(tái)的高通量測(cè)序技術(shù) (陳娟等2018;陳艷紅等2018;Liu et al.2018;譙利軍等2018) 。此外, 針對(duì)特定類群的內(nèi)生真菌也開(kāi)展了DNA提取方法的優(yōu)化及結(jié)合ITS序列及ITS2二級(jí)結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確鑒定 (鐘志敏等2018) , 該方法可對(duì)今后開(kāi)展其他特定類群的內(nèi)生真菌鑒定提供理論借鑒。在內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物研究方面涉及到藥用植物包括沙漠藥用植物 (Li et al.2018) 、南方紅豆杉 (陳淑娟等2018) 、蛇足石杉 (鄭瑞等2018) 以及七葉樹 (劉軍生等2018) 等, 宿主植物生境來(lái)源呈現(xiàn)多元化, 所分離到的次生代謝物均具有較好的生理活性, 如抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制特定酶活性、抑菌作用等, 有些還具有潛在的生態(tài)功能, 如沙漠藥用植物的內(nèi)生真菌中分離到的酚類化合物可抑制其他植物根的生長(zhǎng), 暗示其在宿主植物的生態(tài)適應(yīng)性方面可能起到重要作用 (Li et al.2018) 。在藥用植物與內(nèi)生真菌互作方面既有內(nèi)生真菌對(duì)宿主植物表現(xiàn)出的促生作用 (周麗思等2018) 、對(duì)宿主植物種子萌發(fā)的促進(jìn)作用 (楊建文等2018) , 也有從蛋白組學(xué)及基因組學(xué)水平開(kāi)展的互作機(jī)制的研究 (曾旭等2018a, 2018b) 。整體較好地反映出我國(guó)在藥用植物內(nèi)生真菌方面研究的良好發(fā)展態(tài)勢(shì)。

　　以上分析表明, 內(nèi)生真菌在藥用植物領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用, 將有可能成為實(shí)現(xiàn)藥材優(yōu)質(zhì)、高效、安全、穩(wěn)定、質(zhì)量可控的有效新技術(shù)。但目前, 我國(guó)內(nèi)生真菌在藥用植物領(lǐng)域的應(yīng)用仍處于起步階段, 研究過(guò)的內(nèi)生真菌數(shù)量?jī)H為其巨大資源庫(kù)的很少一部分, 且多限于內(nèi)生真菌對(duì)藥用植物生長(zhǎng)發(fā)育、有效成分、抗逆性等表觀研究, 對(duì)其具體作用機(jī)制仍不明確。利用現(xiàn)代技術(shù)手段, 對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行進(jìn)一步的系統(tǒng)研究亟待開(kāi)展。可以預(yù)見(jiàn), 充分利用內(nèi)生真菌的研究成果將可為藥用植物現(xiàn)代化發(fā)展開(kāi)辟新途徑, 并成為推動(dòng)我國(guó)中藥材產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化、國(guó)際化發(fā)展的新動(dòng)力。

參考文獻(xiàn)（略）

本文轉(zhuǎn)在自《菌物學(xué)報(bào)》2018年01期序言